Trang nhất » Tin Tức » Tin tức thị trường

Ứng dụng Bacillius subtilis như một dòng chế phẩm sinh học tiềm năng trong nuôi cá hồi vân

Ứng dụng Bacillius subtilis như một dòng chế phẩm sinh học tiềm năng trong nuôi cá hồi vân
Cá hồi vân (oncorhynchus mykiss) là một trong những loài cá hồi thương phẩm quan trọng nhất, được nuôi rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Đây là loài cá nước lạnh quan trọng nhất tại Iran. Các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn đang làm suy giảm tỉ lệ sinh sản cũng như chất lượng nước nuôi, trong khi phương pháp điều trị phổ biến nhất là sử dụng các loại thuốc kháng sinh. Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh trên cá hiện đã và đang bị chỉ trích nghiêm trọng. Ngày nay, lợi khuẩn hay những vi sinh vật bổ sung được sử dụng để thay thế thuốc kháng sinh. Lợi khuẩn, là những vi sinh vật (như các vi khuẩn, nấm và nấm men) có thể giúp tăng cường sức khỏe của vật chủ bằng cách cân bằng hệ vi khuẩn đường tiêu hóa. Những loài được sử dụng nhiều hơn cả là Bacillus coagolans, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus claisey and Bacillus licheniformis. Khi được sử dụng như lợi khuẩn được trộn vào thức ăn, chúng sẽ kích thích hệ thống miễn dịch và có hoạt tính kháng khuẩn và ngăn ngừa cạnh tranh. Kể từ khi được báo cáo là không có tác nhân gây bệnh, các chi Bacillus được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản. Bacillus subtilis, còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô hoặc trực khuẩn cỏ, là một loại vi khuẩn Gram dương , catalase dương tính . Thuộc chi Bacillus, Bacillus subtilis là trực khuẩn hình que, có khả năng tạo bào tử, có khả năng chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Bacillus có thể sản sinh các chất kháng sinh, amino axit và enzim, và một lượng lớn peptit, bao gồm subtillin và bacitracin.

Nghiên cứu này đã chỉ ra tác dụng như một lợi khuẩn của B. subtilis dựa trên các chỉ số huyết học và sinh hóa của cá hồi cầu vồng.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu này được thực hiện trong 60 ngày vào mùa đông năm 2011 trên cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss) (Wallbaum) có cân nặng trung bình 60g, được lấy từ một trang trại cá thương mại ở phía bắc Iran. Sử dụng 120 mẫu cá hồi, gồm 2 nhóm (Kiểm soát và Đối chứng) và lặp lại 3 lần. Nhóm 60 con cá được nuôi trong nước ngọt đã khử clo ở nhiệt độ 14,5 độ C, liên tục được cung cấp khi cacbonic, chế độ ăn hàng ngày là thức ăn dạng viên ở mức 2,4% trọng lượng cơ thể.
Chế độ ăn uống thực nghiệm
Cá được cho ăn thức ăn chứa 107 tế bào/g, 3 lần một ngày trong vòng 30 ngày. Để làm được điều này, khuẩn B.subtilis PTCC 1720 đã được nuôi cấy trong môi trường thạch máu trong 48 giờ ở nhiệt độ 25º C, sau đó được ly tâm mức 4000g ở 4ºC trong 10 phút; được rửa 3 lần trong nước muối 0,9%.
Lấy mẫu máu
15 mẫu cá được thu thập ngẫu nhiên từ mỗi nhóm. Cá được gây mê bằng cách ngâm vào nước có chứa 0,1 ppm  tricaine methane sulfonate (MS-222). Toàn bộ số máu (3ml) đã được thu thập từ các tĩnh mạch đuôi, sau đó tiến hành xác định các yếu tố huyết học cơ bản. Để tách huyết thanh, các mẫu máu (2,5ml) được rút ra từ các tĩnh mạch đuôi cá như trước đó, rồi chuyển sang ống Eppendorf không chống đông máu, ly tâm ở 3000g trong 15 phút và huyết thanh được thu thập và lưu trữ ở -20º C cho đến khi sử dụng các chỉ số sinh hóa, gồm Lysozym, IgM, tổng đạm và Albumin.
Đếm số tế bào hồng cầu và bạch cầu
Máu được làm loãng đến tỉ lệ 01:50 trong muối 0,9% và tiến hành đếm trong năm ô vuông nhỏ có tổng diện tích 0,02 mm(tức 1/50 của 1mm3), dưới máy có độ phóng đại 400 lần. Do đó, số lượng tế bào hồng cầu trên mỗi mm3được tính như sau: Số tế bào trong mỗi mm3 = Số tế bào trong 0,02mm3 x 50 (khu vực tính) x 50 (do pha loãng). Số lượng tế bào bạch cầu được đếm theo cách tương tự, nhưng trong ô vuông có diện tích 0,1mm3 do đó công thức tính là: Số tế bào bạch cầu trên mỗi mm3 = Số tế bào đếm được trong 0,1mm3 x 10 (khu vực tính) x 50 (do pha loãng).
Mức hemoglobin
Các phương pháp đo nồng độ hemoglobin khác nhau có thể có độ chênh lệch đáng kể. Phương pháp Thecyanohemoglobin đã được sử dụng như một phương pháp tiêu chuẩn trong một số thập kỷ. Cho một peptit và một mẫu thử 20µl máu cùng 5ml dung dịch Drabkin trong một ống nghiệm và trộn đều. Đặt khoảng 2ml dung dịch này vào một cuvette và đọc các giá trị độ hấp thụ trong một máy quang phổ ở 540nm. Nồng độ hemoglobin của mẫu máu có thể được tính toán từ một hàm chuẩn.
Mức hematocrit
Chỉ số tế bào máu
Chỉ số tế bào máu cung cấp thông tin về nội dung hemoglobin và kích thước của các tế bào hồng cầu. Khối lượng phân tử trung bình (MCV) là kích thước trung bình của một tế bào máu, được tính bằng cách chia hematocrit (Hct) cho số lượng tế bào hồng cầu (RBC).
MCH là số lượng hemoglobin trung bình trên mỗi tế bào máu và được tính bằng cách lấy số lượng Hemoglobin (Hb) chia cho số tế bào hồng cầu (RBC).
Phân biệt lượng bạch cầu
Phim máu từ các mẫu giống nhau được chuẩn bị trên kính icrosscope, cố định trong 5 phút ở methanol 96%. Sau khi để khô trong vài phút ở nhiệt độ phòng, được nhuộm bằng phương pháp Giemsa, và các chế phẩm được kiểm tra bằng kính phóng đại x1000 để xác định tỷ lệ neutrophile, bạch cầu đơn nhân và tế bào bạch huyết. Mỗi nhóm 100-200 tế bào được đếm trên từng mặt trượt.  
Lysozyme huyết thanh
Phân tích Lysozyme dựa trên việc ly giải lysozyme – khuẩn gram nhạy cảm tích cực Micrococcus lysoeikticus. Hoạt động lysozyme của huyết thanh cá hồi vân được đo bằng cách sử dụng phương pháp biến đổi turbidimetry, được mô tả bởi Ellis. Tóm lại, một hệ thống thể vẩn tiêu chuẩn của 0,375g ml-1 M.lysodeikticus đã được chuẩn bị trong 1ml PBS (ph 5,8)
IgM
Nồng độ IgM được xác định bằng phương pháp nephelometry (MININEPH TM Human Kit, the binding Site Ltd, Birmingham, Anh Quốc).
Tổng huyết thanh đạm và huyết thanh Albumin
Tổng huyết thanh đạm và huyết thanh Albumin được đo bằng Pars Azmon Kite Pars Azmon, Iran) trong Autoanalyser (hoshmand-fanavar Co, Tehran, Iran).
Phân tích thống kê
Sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm điều trị đã được thử nghiệm bằng cách phân tích một chiều của phương sai (ANOVA) và so sánh 2 giá trị trung bình đã được thực hiện bởi nhiều thử nghiệm ở khoảng Duncan. Sử dụng khoảng tin cậy P < 0,05. Phân tích thống kê được thực hiện bằng cách sử dụng các chương trình phần mềm SPSS.
Kết quả
Thí nghiệm huyết học và sinh hóa cho thấy bổ sung B.subtilis vào chế độ ăn không ảnh hưởng tới số lượng tế bào hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, MCV, MCH và MCHC và không có sự khác biệt đáng kể nào giữa 2 nhóm. Số lượng hồng cầu của cá được điều trị bằng lợi khuẩn là 1,15 ± 0,05 x 109/ml và cá đối chứng là 1,09 ± 0,06 x 109/ml. Hemoglobin trong cá được ăn B.subtilis là 7,67 ± 0,15g/dl và trong cá đối chứng là 7,73 ± 0,18g/dl. Tỷ lệ phần trăm tương ứng của cá dùng lợi khuẩn và cá đối chứng là 39,77 ± 0,69 và 40,83 ± 1,26. Chỉ số MCV trong nhóm điều trị là 353,65 ± 14,14fl, trong nhóm đối chứng là 381,64 ± 16,36 fl. Chỉ số MCH của nhóm điều trị là 68,44 ± 3,34 và nhóm đối chứng là 71,69 ± 3,43 pg. Chỉ số MCHC trong nhóm cá được ăn B.subtils là 19,33 ± 0,38g/dl và trong nhóm cá đối chứng là 19,02 ± 0,28 g/dl (Bảng 1).
Nhưng số lượng bạch cầu, phần trăm tế bào lympho, tổng huyết thanh đạm và huyết thanh albumin, IgM và liysozyme của nhóm điều trị cao hơn đáng kể so với nhóm kiểm soát, trong khi phần trăm neutrophile và monocyte của nhóm đối chứng là cao hơn so với nhóm điều trị (Bảng 1 và Bảng 2).
Nhìn chung, có sự kích thích hệ miễn dịch (cả miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch) sau khi đưa B.subtilis vào cá hồi vân. Cụ thể, số lượng bạch cầu tăng từ 31,467 ± 2,38x106/ml lên thành 37,133 ± 1,24x106/ml. Tỷ lệ phần trăm của các tế bào lympho trong cá được cho ăn B.subtilis (97.93 ± 0.36) đã cao hơn đáng kể so với của nhóm đối chứng (96.33 ± 0.69). Ngoài ra, các hoạt động lysozyme huyết thanh đã được ghi nhận là 2.94 ± 0.45 mg/ml của nhóm điều trị bằng B.subtilis và nhóm đối chứng là 1.52 ± 0.29 mg/ml. Có sự khác biệt đáng kể trong thống kê IgM từ cá được nhận lợi khuẩn (41.28 ± 5.01 mg/dl) và cá đối chứng (28.55 ± 3.53 mg/dl). Cá được ăn B.subtilis có tổng lượng đạm cao hơn (4.75 ± 0.11 g/dl) so với nhóm đối chứng (4.44 ± 0.10 g/dl). Huyết thanh albumin ở nhóm điều trị cao hơn đáng kể (2.63 ± 0.10 g/dl) so với nhóm đối chứng (2.29 ± 0.12 g/dl). Tỷ lệ phần trăm của monocyte trong nhóm điều trị là 0,07 ± 0,07 và ở nhóm đối chứng là 0,20 ± 0,11. Hơn nữa, tỷ lệ neutrophile của nhóm được ăn B.subtilis (2.00 ± 0.34) thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (3.47 ± 0.64).
Thảo luận
Nhờ các điều kiện lý tưởng ở tỉnh Mazandaran, đàn cá hồi đã được phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây, những trại nuôi mới đã được thành lập và sản lượng tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, một loạt các bệnh truyền nhiễm phát triển ngay trong đàn cá. Thực tế cho thấy mầm bệnh đã luôn tồn tại trong môi trường nước nuôi, có vẻ như việc bản vệ đàn cá chống lại tác nhân gây bệnh là điều quan trọng nhất, dễ dàng nhất và tiết kiệm nhất để ngăn chặn các thiệt hại và tổn thất do bệnh truyền nhiễm. Các kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng B.subtilis kích thích cả hệ miễn dịch tế bào và miễn dịch thể dịch. Vai trò của lợi khuẩn trong việc tác động tới phản ứng miễn dịch của cá đã được báo cáo trước đây là có tác dụng điều tiết quan trọng trong phản ứng miễn dịch bẩm sinh và thích ứng của các vật chủ. Việc bổ sung B.subtilis trong khẩu phần dinh dưỡng của cá hồi vân không ảnh hưởng tới tỉ lệ hematocrit, hemoglobin, số lượng tế bào máu, MCV, MCH và MCHC. Những kết quả tương tự cũng thu được bởi các tác giả khác. Đồng thời cho thấy B.subtilis dẫn đến sự gia tăng của tỷ lệ phần trăm của các tế bào lympho trong khi giảm tỉ lệ neutrophile và monocyte, nguyên nhân là do hiệu ứng của lợi khuẩn trên hệ thống miễn dịch. Ngoài ra, các tế bào lympho là một trong những yếu tố bảo vệ quan trọng nhất của cá trong chống lại vi khuẩn gây bệnh, đồng thời kích thích tiết ra các cytokine, bao gồm interleukin 4 – dẫn đến sự tăng cường phát triển các tế bào sẽ trở thành máu và sự đặc biệt của các nhóm tế bào myeloid, và tăng cường đáng kể các hoạt động của đại thực bào. Tỷ lệ phần trăm lymphocyte ở cá hồi tăng lên giúp hệ thống miễn dịch hoạt động mạnh trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh, giảm tỉ lệ tử vong. Nhờ gia tăng tổng lượng đạm và albumin trong nhóm điều trị, có thể kết luận về cách thức gia tăng của các nhân tố đã đề cập ở trên. Các kết quả tương tự cũng được ghi nhận bởi các tác giả khác. Tỷ lệ IgM trong nhóm điều trị cao hơn so với nhóm đối chứng. Chế phẩm sinh học khác nhau hoặc một loài hay vài loài khác nhau có thể gây ra tăng thực bào, lysozyme, hô hấp ồ ạt và cũng sản xuất ra những cytokine khác nhau trong cơ thể cá và có thể kích thích hệ thống miễn dịch của dạ dày cá thông qua việc tăng các tế bào kháng thể và acidophil granulocyte. Quá trình sản xuất các globulin miễn dịch trong cơ thể cá là sự xuất hiện của một loạt các phản ứng giữa các tế bào kháng nguyên, các tế bào hỗ trợ T và interleukin kích thích các tế bào lympho B. Rồi những tế bào limpho sản xuất huyết tương. Các kết quả thu được từ tỷ lệ huyết thanh lysozyme cho thấy huyết thanh lyysozyme trong nhóm nhận lợi khuẩn cao hơn so với nhóm đối chứng. Lysozym là một tham số quan trọng về miễn dịch thể dịch bẩm sinh, được phân phối rộng rãi trong động vật không xương sống và động vật có xương. Lysozym có hoạt tính kháng khuẩn, bằng cách tấn công peptidoglycan trong thành tế bào của vi khuẩn, chủ yếu là vi khuẩn gram dương, gây ly giải và kích thích các thực bào của vi khuẩn. Có thể gia tăng nồng độ lysozym trong máu của cá bằng cách làm cho nhiễm trùng hay sự xâm nhập của các loài ngoại lai. Vì vậy, có thể kết luận rằng khuẩn B.subtilis có thể kích thích các thông số miễn dịch ở cá hồi vân. Các đáp ứng miễn dịch của cá hồi vân bao gồm sự gia tăng đáng kể về số lượng bạch cầu, phần trăm tế bào lympho, tổng huyết thanh đạm và huyết thanh albumin, IgM và lysozyme. Kết quả này cũng gợi ý rằng một số thí nghiệm khác có thể được thực hiện bằng cách sử dụng những loài cá khác với liều B.subtilis khác để thiết lập vai trò của B.subtilis như một chất kích thích miễn dịch.
Những bài viết khác
» Quản lý sản phẩm xử lý, cải tạo môi trường dùng trong nuôi trồng thủy sản
» Hội nghị sơ kết 2 năm thực hiện tái cơ cấu ngành thủy sản
» Nghị định về một số chính sách phát triển thủy sản
» Chiến lược Hội nhập kinh tế quốc tế ngành nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2030
» MỞ RỘNG THỊ TRƯỜNG, TĂNG CƯỜNG XÚC TIẾN THƯƠNG MẠI ĐỂ ĐẨY MẠNH XUẤT KHẨU NÔNG, THỦY SẢN